β-肾上腺素受体对星形胶质细胞Lactate代谢及胰岛Somatostatin合成的调控及机制

【摘要】应激反应是面对外界或内部的胁迫刺激,机体产生的一种积极主动的生理变化,以避免意外伤害,并且可以大幅度提高面对困难环境的能力。在应激条件下,机体产生多种应激激素,包括肾上腺素(Epinephrine,EPI)、去甲肾上腺素(Norepinephrine,NE)、糖皮质激素、血管紧张素等。作为最重要的应激激素,EPI和NE主要通过作用在靶细胞表面的肾上腺素受体(Adrenergicreceptors,AR)来调节机体的功能。依据肾上腺素在不同的组织上产生的生理效应不同,1948年Alquist提出肾上腺素受体可以分为α和β两种亚型。α肾上腺素受体激活后介导的主要生理功能包括：促进平滑肌的收缩,抑制胰岛素的分泌,升高血压等。β-肾上腺素受体与α-肾上腺素受体介导的生理功能不完全相同,β-肾上腺素受体激活后介导的主要生理功能包括：舒缓平滑肌,促进胰岛素分泌,促进脂肪分解等。随着生物化学和分子生物学研究进展,人们发现α-肾上腺素受体又可分为主要与Gq偶联的α1-肾上腺素受体和主要与Gi偶联的α2-肾上腺素受体。β-肾上腺素受体分为三个亚型β1、β2和β3-肾上腺素受体。因为β-肾上腺素受体和α-肾上腺素受体激活后在许多生理效应上差异很大,所以选择性激活β-肾上腺素受体的小分子化合物通常也可称为β-肾上腺素受体激动剂,而选择性激活α-肾上腺素受体的小分子化合物则称为α-肾上腺素受体激动剂。应用多种具有选择性的激动剂,结合基因敲除小鼠等动物模型,过去的半个世纪对α-肾上腺素受体激动剂和β-肾上腺素受体激动剂产生的多种生理功能的研究取得了很多进展。然而,由于肾上腺素受体的广泛分布和受多种环境因素的调节等特性,人们对α-肾上腺素受体激动剂和β-肾上腺素受体激动剂在有些生理过程中的调节作用还不完全清楚。因此α-肾上腺素受体激动剂和β-肾上腺素受体激动剂对生理功能的调节一直以来都是国内外研究的热点。近些年来,对β-肾上腺素受体激动剂调节生理功能和病理过程的显著进展有很多。美国Duke大学Lefkowitz实验室发现β-肾上腺素受体可以通过与NHERF(Na+/H+exchangerregulatoryfactor)结合,调节Na+/H+交换,维持肾脏的酸碱平衡；上海生科院裴钢实验室发现异常激活的β-肾上腺素受体与ghrelin相互作用,增加了γ-分泌酶活性,加速淀粉样蛋白斑块的形成,促进了阿尔茨海默病的发生；有报道长期慢性应激条件下,β-肾上腺素受体异常激活会导致DNA损伤,引起基因组的不稳定。本论文中,我们通过药物干预的办法,加入不同的β-肾上腺素受体肾上腺素受体的激动剂(Epinepherine.Isoproterenol)和拮抗剂(ICI118,551、Metaproterenol.Propranolol.Phentolamine),结合细胞模型以及相同遗传背景的WT小鼠和β1AR-/-β2AR-/-、β1AR-/-、β2AR-/-、β-arrestinll-/-、β-arrestin2-/-的KO鼠为研究对象,探讨了β-肾上腺素受体的激动剂对星形胶质细胞中乳酸(lactate)生成和转运的调节机制。深入研究了β-肾上腺素受体激动剂对胰岛中生长抑素(Somatostatin,SST)合成的调节机制。第一章β-肾上腺素受体对星形胶质细胞Lactate代谢的调控及机制β-肾上腺素受体的三个亚型在神经系统均有表达。研究表明,激活啮齿类动物海马、杏仁核和前额叶皮层中的β2-肾上腺素受体能促进长时程增强,从而加强学习记忆。研究发现增强学习记忆所需的能量,一部分是通过星形胶质细胞中糖原分解获得。在中枢神经系统,糖原主要储存在星形胶质细胞中。静息状态下,神经元活动所需要的能量主要由葡萄糖提供。但在低血糖、低氧、神经活动过强等应激状态下,动员星形胶质细胞中糖原分解产生乳酸是神经元获能方式之一。脑组织中,糖酵解主要发生在星形胶质细胞内,乳酸是糖酵解的终产物。神经元摄取的乳酸主要来源于星形胶质细胞中糖原分解产生。乳酸的转运依赖于单羧酸转运蛋白(monocarboxylatetransporter,MCT)穿梭于星形胶质细胞和神经元之间。MCT1和MCT4主要表达在星形胶质细胞,而MCT2表达在神经元。抑制MCT1,MCT2和MCT4的表达均可导致乳酸转运障碍,引起长期记忆损伤。以上结果表明,乳酸在星形胶质细胞和神经元之间穿梭是长期记忆形成的必要条件。以往人们更多地关注β-肾上腺素受体或乳酸对学习记忆的影响,为学习记忆过程提供能量的乳酸代谢研究的比较少。尤其是星形胶质细胞中,β-肾上腺素受体如何调节乳酸生成及转运的机制尚未明确。为了更好的理解星形胶质细胞中β-肾上腺素受体对乳酸生成及转运的调节机制,我们在体外分离得到β1AR+/+/β2AR+/+β1AR’-/-/β2AR-/-星形胶质细胞,并利用U251细胞系,通过药物干预的方法,应用多种肾上腺素受体激动剂(如Epinepherine、Isoproterenol)和拮抗剂(如ICI118,551.Metaproterenol),研究β-肾上腺素受体调节乳酸生成及转运的分子机制。为神经元退行性疾病引起的记忆损伤机制及治疗,提供一定的理论基础。我们取得以下研究结果：1.我们应用β-肾上腺素受体激动剂肾上腺素(Epinepherine,EPI)和肾上腺素的类似物异丙肾上腺素(Isoproterenol,ISO)孵育从β1AR+/+/β2AR+/+WT小鼠和β1AR-/-/β2AR-/-KO小鼠中分离的原代星形胶质细胞。结果显示,β1AR+/+β2AR+/+星形胶质细胞胞外释放的乳酸量明显增加；而β1AR-/-/β2AR-/星形胶质细胞释放的乳酸量并无显著性增加。β2-肾上腺素受体特异性阻断剂ICI118,551能明显降低乳酸的释放量,而β卜肾上腺素受体特异性阻断剂Metoprolol却不能明显阻断乳酸的增加。在U251细胞系验证了以上结果。实验结果表明,β-肾上腺素受体,尤其是02-’肾上腺素受体的激活介导着星形胶质细胞中乳酸的生成及转运。2.为了进一步探讨β-肾上腺素受体的激动剂引起星形胶质细胞内乳酸生成及转运增加的机制,我们应用Westernblotting技术,检测了与乳酸生成及转运密切相关的LDHA、MCT1和MCT4的蛋白表达情况。结果显示：三种蛋白表达水平均增加,尤其是MCT1增加的最明显,并都呈一定的时间依赖性。这种增加趋势可被β2-肾上腺素受体特异性阻断剂ICI118,551所阻断。实验结果提示：β2-肾上腺素受体的激动剂ISO通过调节LDHA、MCT1和MCT4的表达,调节星形胶质细胞中乳酸的生成及转运。3.为了探究β-肾上腺素受体是否通过调节LDHA、MCT1和MCT4转录激活来影响其蛋白表达。我们利用β-肾上腺素受体的激动剂ISO孵育星形胶质细胞后,检测到LDHA,MCT1和MCT4的mRNA水平增加,并具有一定的时间依赖性。进一步研究发现,转录调节因子HIF-1α(hypoxiainduciblefactor-1,HIF-1)在MCT4和LDHA的转录激活过程中起重要作用；而转录调节因子CREB(cAMP-responseelementbindingprotein,CREB)在MCT1的转录激活过程中发挥作用。4.为了进一步研究β-肾上腺素受体激动剂ISO调节LDHA.MCT1和MCT4转录激活机制。我们应用选择性的小分子化合物抑制剂、结合RNA干扰、免疫荧光和免疫共沉降等实验方法。结果发现：β-肾上腺素受体激动剂ISO主要通过β-。肾上腺素受体-β-arrestinl-pERK信号途径,磷酸化了HIF-1α的T506/S515位点,促进HIF-1α进核,与HIF-1β形成有活性的HIF-1。HIF-1作为转录调节因子调控MCT4和LDHA的转录激活。ISO通过另外一条信号通路β-AR-Gs-PKA,磷酸化CREB的S133位点,激活的CREB调节MCT1的转录激活。5.初步研究了β-肾上腺素受体调节星形胶质细胞中乳酸的生成和转运所影响的相关生理功能,我们使用β-肾上腺素受体的激动剂ISO处理具有相同遗传背景的β1AR+/+/β2AR+/+WT小鼠和β1AR-/-β2AR-/-KO小鼠,检测其海马区与学习记忆相关的分子CREB和ERK的激活情况,利用WesternBotting技术检测了与乳酸代谢密切相关的蛋白MCT1,MCT4和LDHA的表达情况。结果显示：海马区的LDHA,MCT1和MCT4蛋白表达增加；ERK和CREB磷酸化水平增加。实验结果提示,学习记忆的形成可能与β-肾上腺素受体介导的星形胶质细胞中乳酸代谢有一定的关系。综上所述,我们发现β-肾上腺素受体的激动剂ISO主要通过β-AR-Gs-PKA和β-AR-β-arrestinl-pERK两条信号通路共同调节星形胶质细胞中LDHA,MCT1和MCT4的转录激活,从而调节星形胶质细胞中乳酸的生成及转运。本研究首次发现p-ERK磷酸化HIF-1α的T506/S515位点,促进了HIF-1α的进核形成有活性的HIF-1,调节MCT4及LDHA的表达。乳酸为神经元提供能量并且激活与学习记忆相关的关键分子CREB和ERK1/2。这些结果将有助于深入研究乳酸代谢障碍引起的神经退行性疾病导致学习记忆障碍的发病机制。第二章β-肾上腺素受体对胰岛Somatostatin合成的调控及机制胰岛是许多大小不等、形状不定的细胞团,散布在胰腺各处,人类的胰岛细胞按其形态学特点,主要分为α细胞、β细胞、δ细胞和PP细胞。α细胞分泌胰高血糖素；β细胞分泌胰岛素；δ细胞分泌生长抑素(Somatostatin,SST)；PP细胞分泌胰多肽。这些细胞形成微调网络,共同调节激素的释放,维持胰岛正常的生理功能。δ细胞分泌的SST通过靶细胞膜上的生长抑素受体介导,负性调节多种生理功能。胰腺δ-细胞分泌的SST除了受血糖含量的影响外,外界环境的改变也会对其造成影响。研究发现血管活性肠肽(VIP),胰高血糖素和肾上腺素均能促进SST的分泌。SST是胰岛中重要的激素,其分泌异常将会导致胰岛功能紊乱。如果δ细胞中SST的合成与分泌不平衡,将会影响SST的正常分泌,δ细胞不能执行正常的生理功能。研究已经表明,胰腺6细胞主要通β-肾上腺素能系统调节SST分泌。然而,肾上腺素能系统在调节SST合成机制尚未明确。我们通过不同的激动剂(Epinepherine.Isoproterenol)和拮抗剂(ICI118,551.Metaproterenol、Propranolo、Phentolamine)处理具有相同遗传背景的β1AR’+/+/β2AR+/+野生型和B1AR-/-/β2AR-/-KO小鼠；β-arrestinl+/+野生型和β-arrestinl-/-KO小鼠；β-arrestin2+/+野生型和β-arrestin2-/-KO小鼠的胰岛和能分泌SST的δ细胞系TGP52,探讨胰岛中的肾上腺素受体调节SST合成的机制。取得了以下研究结果：1.利用QCR和ELISA方法检测SST的合成情况。结果发现β-肾上腺素受体的激动剂Epinepherine和Isoproterenol都能促进胰岛和δ细胞系TGP52中SST的合成。β1AR-/-/β2AR-/小鼠、β-arrestinl-/小鼠胰岛中SST的合成比WT小鼠明显降低约50%,而β-arrestin2-/-KO小鼠胰岛中SST的合成无明显降低。实验结果显示,β-肾上腺素受体的激动剂通过β-arrestinl途径介导SST的合成。2.为了深入了解β-肾上腺素受体的激动剂对胰岛δ细胞中SST合成的调节机制,我们利用双荧光素酶报告基因,结合GloSensor测定第二信使及突变转录因子结合位点等方法,研究β-肾上腺素受体对SST表达的调节机制。实验结果显示,β-肾上腺素受体的激动剂EPI/ISO通过PKA途径,磷酸化CREB的133位,激活的CREB结合到SST启动子的CRE区,调节SST的转录。通过β-arrestinl-ERK途径磷酸化Pax6的S313和S398位点,激活的Pax6与Pdxl形成复合体结合在SST的SMS-UE区,调节SST的转录。综上所述,我们的研究结果表明β-肾上腺素受体激动剂促进了胰岛中SST的合成,通过Gs-cAMP-PKA-CREB途径和β-arrestinl-ERK-Pax6途径共同调节转录因子CREB和Pax6的激活,从而调节SST的合成。实验结果提示：δ细胞中β-肾上腺素受体功能障碍,不仅影响SST的分泌,还影响SST的合成,最终导致胰岛δ细胞功能障碍。
【作者】董俊红；
【导师】于晓；孙金鹏；
【作者基本信息】山东大学，生理学，2014，博士
【关键词】GPCR；Adrenergicreceptor；Astrocyte；Lactate；Islet；Somatostatin；

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